二至丸与失笑散对胆汁淤积性肝纤维化大鼠uPA的调控(2)

HE染色、胶原纤维染色（天狼猩红染色）、肝纤维化程度分级标准［3］：汇管区纤维组织无增生为“-&rdquo；；增生后面积占肝小叶1/3以下为”+“；占肝小叶1/3～2/3为”++“；占肝小叶2/3以上为”+++“。每个”+“记1分，每个标本记总分。积分越高，表明肝脏纤维化程度及发病机理损害越严重。

2.3.5Western印迹法检测

肝组织中uPA蛋白含量取-80℃保存的肝组织标本各100mg，剪碎后于液氮中研磨成粉末状，收集于Eppendorf管后，提取肝组织蛋白匀浆，以紫外分光光度计（650nm）测定蛋白浓度。取含60μg蛋白肝组织匀浆，变性处理后经10%SDS-PAGE电泳分离，4℃条件下经2～3h将蛋白电转移至硝酸纤维素膜，置膜于含50g/L脱脂牛奶中（TBST缓冲液稀释）封闭1h.分别加入特异性兔抗鼠uPAmAb（1∶1000稀释）、鼠抗鼠β-actinmAb及辣根过氧化物酶标记的抗兔、抗鼠多克隆抗体（1∶5000稀释）进行免疫反应，以增强化学发光显色系统显色，超敏胶片曝光，以β-actin为内参照。

2.3.6RT-PCR法检测

肝组织PAI-1mRNA表达取-80℃保存的大鼠肝组织标本，匀浆后用TRIZOL试剂抽提总RNA.采用分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度，OD260/OD280在1.8～2.0之间。引物序列：PAI-1（+）GTGGTTCGGCACAATCCAACAGAG（1268），PAI-1（-）GCAATGGAGGACGATACAAGAGGT（1709）。β-actin（+）TGTGATGGTGGGTATGGGTCAGAAG（207），β-actin（-）TCACGGTTGGCCTTAGGGTTCAGAG（431）；PCR扩增：49μl体系：1ststrandcDNA5μl，10×PCRBuffer5μl，dNTP1μl，目的基因正负链各2μl，β-actin正负链各2μl，H2O29μl，Taq酶1μl；PCR循环条件：95℃预变性5min，95℃30s，60℃40s，72℃1min，30次循环，72℃10min.PCR产物加样于2%琼脂糖凝胶，电泳（上样量12μl，6×DNAloadingbuffer2μl，电压150v，电泳35min）紫外灯下观察，凝胶分析系统拍照，计算机图像扫描和吸光度值分析，计算PAI-1/β-actinmRNA的相对表达量。

2.4统计分析

各组计量资料以±s表示，计量资料采用方差分析，等级资料采用秩和检验，应用SPSS12.0软件进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1动物一般情况变化

假手术组大鼠毛发有光泽，体重增加，体态活泼，食量及二便正常。胆管结扎大鼠2～3d后出现小便发黄，术后7d，出现尾部黄染、耳黄、毛黄染等黄疸表现。

3.2肝脏形态变化

假手术组肝脏表面光滑，呈红褐色，质地软。模型对照组大鼠肝脏体积增大，表面黄染，质地较硬。3个中药复方组大鼠肝脏体积较模型组小，表面较模型对照组光滑。

3.3不同治则中药复方对模型大鼠肝功能的影响

结果见表1.表1不同治则中药复方对模型大鼠肝功能的影响（略）

3.4不同治则中药复方对模型大鼠肝组织发病机理的影响

HE及天狼猩红染色显示，假手术组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，呈放射状，肝窦正常，胞核结构清晰。模型对照组大鼠肝脏内小胆管大量增生，以汇管区为中心呈放射状向肝实质内延伸，增殖的胆管呈花环样，胆管上皮细胞周围有肌成纤维细胞的聚集和细胞外基质的沉积；肝细胞与增生的胆小管相比明显减少，剩余肝细胞的形态结构尚正常。与模型对照组比较，3个中药组小胆管增生较模型组明显减少，剩余肝细胞量较多；合方组较两个中药单方组发病机理改变轻，失笑散组和二至丸组无明显差异；模型及药物组的炎症及坏死均不明显。结果见表2.表2不同治则中药复方对模型大鼠纤维化程度的影响（略）

3.5不同治则中药复方对模型大鼠肝组织uPA蛋白表达的影响（医学网搜集整理）

Westernblot检测显示，假手术组大鼠肝组织uPA表达极低，模型对照组uPA表达显著高于假手术组（P<0.01），与模型对照组比较，失笑散组、二至丸组及合方组uPA表达显著增强（P<0.01），3个中药复方组之间比较，合方组最高，失笑散组次之，再次为二至丸组，3者之间统计有显著差异（P<0.05，P<0.01）。见图1.

3.6不同治则中药复方对模型大鼠肝组织PAI-1mRNA表达的影响