二至丸与失笑散对胆汁淤积性肝纤维化大鼠uPA的调控

【摘要】目的研究不同治则中药复方二至丸与失笑散对胆汁淤积性肝纤维化大鼠uPA/PAI-1纤溶途经的调控作用。方法SD雄性大鼠60只随机分为假手术组和造模组，造模组于1周后随机分为模型对照组、二至丸组、失笑散组及合方组。各治疗组分别给予相应药物灌胃，模型对照组和假手术组给予等量生理盐水灌胃，4周末处死大鼠。观察内容包括一般情况、肝功能、肝组织发病机理、Western印迹法检测uPA蛋白表达、RT-PCR法检测肝组织PAI-1的表达。结果与模型对照组比较，3个中药复方均能降低胆汁淤积性肝纤维化大鼠血清ALP，ALT，AST水平（P<0.01），失笑散及合方能降低TBil（P<0.01）；合方改善ALP，ALT优于两个单方。3个复方均能不同程度地减轻模型大鼠肝纤维化程度（P<0.01），合方优于两个单方。3个复方均能显著降低胆汁淤积性肝纤维化大鼠PAI-1mRNA表达（P<0.01），提高uPA的表达（P<0.05，P<0.01）。合方对上述环节的调控优于两个单方。结论不同治则中药复方均能改善胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝功能，减轻纤维化程度，合方作用优于两个单方，其机制可能与通过调控uPA/PAI纤溶途径有关。

【关键词】胆汁淤积性肝纤维化；二至丸；失笑散；尿激酶型纤溶酶原激活物；尿激酶型纤溶酶原激活物抑制物

肝纤维化的本质是细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）合成增多而降解相对减少，使过多的ECM沉积于肝内。肝星状细胞（heparstellatecell，HSC）是调控肝脏ECM沉积的最重要细胞，其激活是肝纤维化发生的中心环节。HSC对ECM调节的重要途径之一就是通过尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）和其抑制物（PAI）的差异表达，调控纤溶酶和基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）家族的活性，以维持ECM合成与降解之间的平衡。祖国医学普遍认为，“正虚血淤”是肝纤维化的基本病机［1］。本研究旨在观察补益肝肾和活血化淤的经典名方二至丸和失笑散及其合方对大鼠胆汁淤积性肝纤维化形成的影响及其对uPA/PAI的调控作用，为中医药防治以细胞外基质沉积为特征的肝纤维化提供更广阔的途径。

1材料与仪器

1.1动物

SD雄性大鼠60只，SPF级，体重（260±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2003-0003.饲养于上海中医药大学附属龙华医院实验动物中心，自由饮食。

1.2试剂与器材

盐酸氯胺酮（上海第一生化药业公司，国药准字：H31021897）；HE、天狼猩红染液（上海虹桥乐翔医用试剂有限公司）；血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血清门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清总胆红素（TBil）、血清碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；DEPC（Sigma）；TrizolRea-gent、AMVRT/PCRKit、DNAMarker、引物合成（上海申能博彩生物科技有限公司）；UV-2102C分光光度计（尤尼克公司）；PCR仪、DNA水平（Biorad）；RNA/DNAcalculator（Pharmacia）；凝胶成像系统（上海四星生物技术有限公司）；uPA抗体试剂盒（SantaCruzBiotechnologyINC）。

1.3药物制备

二至丸出自清·汪昂《医方集解》，由旱莲草、女贞子等份（各9g）组成；失笑散出自宋·《太平惠民和剂局方》，由五灵脂、蒲黄等份（各6g）组成；合方：由旱莲草、女贞子各9g，五灵脂、蒲黄各6g组成。根据大鼠剂量=人剂量×35（人转换因子）/6（大鼠转换因子）计算出人鼠等效剂量二至丸为175g·kg-1·d-1，失笑散为1.17g·kg-1·d-1，合方为2.92g·kg-1·d-1，均按传统工艺制备成水煎剂，减压浓缩分别至1.75，1.17，2.92g/ml备用（所有药物制备、质控由上海中医药大学附属龙华医院制剂中心完成）。

2方法

2.1模型制备

参照文献［2］采用胆管结扎复制胆汁淤积性肝纤维化模型。术前禁食不禁水12h，盐酸氯胺酮100mg/kg肌肉注射麻醉，常规腹部皮肤消毒，沿腹正中线切开皮肤，暴露胆总管，于远近端结扎胆总管，中间离断，关腹；假手术组仅开腹暴露并游离胆总管不结扎，关腹。

2.2动物分组及给药

将大鼠随机分为假手术组10只，其余50只为造模组，术后因结扎线脱落、消化道出血及腹水等原因有8只死亡，造模1周后，造模组随机分为模型对照组（12只），二至丸组、失笑散组及合方组（各10只）。术后1周开始，各治疗组分别给予相应药物灌胃，1次/d，共计3周；假手术组与模型对照组以同体积生理盐水灌胃。4周末以盐酸氯胺酮腹腔注射麻醉（100mg·2ml-1·kg-1），腹主动脉采血，处死全部实验动物，分离血清，-80℃保存备用。摘取肝脏称重后，于肝右叶切取1.0cm×1.0cm×1.0cm大小肝组织2块，4%中性甲醛溶液固定，剩余肝脏-80℃条件下保存备用。

2.3指标检测

2.3.1一般情况

包括精神状态、活动情况、皮毛光泽度、食量、大小便情况等。

2.3.2肝脏形态包括肝脏的外形、色泽、质地。

2.3.3生化指标测定ALT，AST，TBil，ALP按试剂盒说明书操作。

2.3.4发病机理学检测