抗原抗体反应的应用(4)

人的瘤细胞株U—266常用来与人外周血B细胞融合以获得人源单克隆抗体。另一些淋巴母细胞抹（LCL）则来源于EB病毒转化的淋巴细胞，如GMl500，W1—L2和ARH77等也用于杂交瘤细胞的制备。这些细胞系表现ED病毒核抗原（EBNA）阳性，且形成的杂交瘤细胞抗体的分泌水平不高。

获得人单克隆抗体的另一方法是用EBV直接转化某些抗体分泌细胞，使之成为“不死”的细胞在体外培养。EBV感染人B细胞后，病毒基因插入人B细胞基因组中，有1%的细胞转化为“不死”的细胞。B细胞转化可通过“病毒驱动”和“细胞驱动”两种方法获得。前者是将B细胞与分泌EBV的B95—8细胞系一同培养，后者则是与EBNA阳性的LCL细胞一同培养。“细胞驱动”转化的B细胞比较稳定，抗体分泌能力也较强。

人淋巴母细胞系和人杂交瘤细胞较难获得，人单克隆抗体也可以通过异源杂文的办法制备，即将EBV转化的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，将获得的异源杂交瘤细胞再与免疫后的B细胞融合，得到人单克隆抗体分泌细胞，不产生自身免疫球蛋白，EBVA也是阴性。

基因工程抗体的制备

抗体的化学修饰：

抗体Fc段用双功能连接剂与荧光素，同位素，酶，发光化合物，稀土元素以及药物，毒素等连接后，并不影响其Fab功能区与特异性抗原结合。根据交联物的性质不同，标记的抗体可用作诊断试剂，也可作为药物的定向载体，引导药物或毒素到达抗原存在部位使药物或使毒素发挥更有效的作用，即俗称“生物导弹”。从而减少药物、毒素、同位素、酶在肿瘤治疗过程中引起严重的副作用，大大提高治疗肿瘤的效果。

许多毒素如蓖麻毒素，白喉毒素，天花粉，红豆毒素等均为蛋白质或糖蛋白，可用双功能剂与抗体相连；吗啡，前列腺素，氨甲喋吟，磷酸酯酶C等含有羧基能用碳二亚胺（EDC），混合酸酐法与抗体的氨基形成酰胺键；同样，含脂肪胺的药物如庆大雷素，阿霉素在水溶性EDC的作用下与抗体的羧基连接；而含芳香胺的药物则先在低温下与亚硝酸作用形成重氮化合物，再与抗体分子上的酪氨酸或组氨酸残基形成偶氮键。总之通过抗体的化学修饰把抗体的特异性用到定向给药和定位检测上。

抗体基因文库

抗体基因文库（antibodyrecombinationlibrary）是将不同的重链和轻链基因随机组合，克隆到合适的表达载体中，在原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体库，从这个抗体库中，用抗原可以筛选到相应的抗体基因。抗体基因来源于杂交瘤细胞或动物B细胞（免疫或未免疫）的DNA和mRNA.

用质粒作为抗体文库的载体，虽然也可能表达有活性的抗体分子或片段，但由线状噬菌体表达更为方便有效。M13、fd、F1等噬菌体的外壳蛋白由5种蛋白组成：pⅢ、pⅥ、pⅦ、pⅧ和pⅨ。每种含量不一，其中pⅧ含量最多，每个噬菌体有2700个pⅧ亚基，其余4种蛋白仅5个拷贝。增加噬菌体外壳蛋白的长度并不影响噬菌体的装配，抗体以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面。噬菌体表达质粒常用的有fd－CAT1、fd－tet－DOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等。抗体融合蛋白构建多用pⅢ和pⅧ，pⅧ拷贝数高，低亲和力的抗体蛋白容易筛选出来。

在噬菌体表达抗体时，常常不表达完整的抗体分子，（因为CH2上不能进行糖基化）。根据不同的引物得到重链的VH或VHCH1区，轻链的VL或VLCL区。VL和VH两个片段用一短肽作连接片段，形成单链可变区（single－chainfragmentvariable，scFv）；VHCH1和VLCL两片段则形成Fab片段。另外，单独的VH和VL也能结合抗原，如果二者形成同源或异源二聚体（dAb），则稳定性和亲和性明显提高（图7—4）。此外在抗体片段DNA末端加上一些功能蛋白（如碱性磷酸酶和蛋白毒素）的基因，则表达的抗体就带有一定生物活性功能片段，可用于检测或治疗。如果在抗体基因末端加上终止子（TAG）则表达的抗体片段是可溶性的，而不是结合在噬菌体表面。

用特异性抗原免疫的动物B细胞构建抗体的噬菌体文库，抗体亲和性高，用与免疫抗原不同的抗原筛选得到的抗体亲和性普遍较低。可用模拟天然体细胞突变的方法来提高亲和力。如混杂重组法，即将己获得的轻链或重链的V片段切下，再克隆至随机的文库中的V区构成二级文库，使H链和L链混杂，可以使抗体片段的亲和性提高。利用PCR错配将随机突变引人至抗体的抗原结合区，也能提高对抗原的亲和力。先用低亲和力的载体在噬菌体的PⅧ表达，筛选后、将抗体基因片段PCR扩增转至PⅢ上表达，可获得高亲和力的抗体片段。

抗体基因文库有两个优点，一是从不适合进行人工免疫的物种获得单克隆抗体，如人源单克隆抗体；二是可快速方便获得单克隆抗体。

抗体基因的改造