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抗原抗体反应的应用(3)

http://www.ykbg.net/ 来源:医考必过网 2016-11-17 12:07
在融合后的细胞培养过程中,饲养细胞(feedercell)有助于杂交瘤细胞的生长。饲养细胞可用同种动物的腹腔细胞或胸腹细胞。腹腔细胞中的吞噬细胞能清

在融合后的细胞培养过程中,饲养细胞(feedercell)有助于杂交瘤细胞的生长。饲养细胞可用同种动物的腹腔细胞或胸腹细胞。腹腔细胞中的吞噬细胞能清除死亡细胞碎片。使背景更为清洁“干净”。同时饲养细胞分泌的细胞因子或活性物质有助于杂交瘤细胞的生长。现有商品“杂交瘤细胞生长因子”可用于替代饲养细胞。

(2)阳性杂交瘤细胞的筛选与单克降化:杂交细胞经约10—14d培养后,形成可用的细胞集落(克隆)。经过几次更换培养液(HT培养液)后进行抗体活性检测。常用的筛选枪测方法是ELISA和凝集试验,前者常用于可溶性抗原,后者适用于细胞、细菌等表面抗原。此外,Dot-ELISA、免疫印迹及免疫荧光试验均可用于杂交瘤细胞的筛选。

使许多细胞克隆混合生长的细胞分离为单个的细胞克隆的过程称克隆化(colonization)最常用的单克隆化方法是有限稀释法(limiteddilution),即将混合细胞经稀释后分装于培养板上,使培养板的大部分孔中只出现一个细胞。为了确保抗体分泌细胞来源于单个细胞,克隆化过程可重复进行,称为亚克隆化(subclonization)。除有限稀释法外,荧光激活细胞分拣法(FACS)也用于杂交瘤细胞的克隆化过程。

单克隆抗体的扩大生产

产生特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株应立即扩大培养,以获得足够的细胞用于保存和生产可供应用的抗体。生产大量单克隆抗体的方法目前常用的有3种:小鼠腹水制备、大瓶培养和中空纤维反应器,前者多用于实验室制备,后二者适应于工厂化生产。

腹水制备:杂交骨髓瘤细胞在腹腔中定植,并产生大量腹水。选用与单克隆抗体制备所用相同的动物品系或者含有相同基因的Fl代杂交品系。杂交F1代品系更适合于腹水制备,如果用异源动物制备腹水时可选用无MHC限制性的裸鼠。用小鼠制备腹水时,先用矿物油或Pristane致敏,以抑制其免疫功能,利于腹水的形成。腹腔注射10—10个杂交瘤细胞,经过7—10d后形成腹水。每只小鼠可获得3—5mL腹水,每mL含IgG抗体可达5—10mg.腹水中含有较多的杂蛋白和非特异性IgG,并且含有许多蛋白酶,易使抗体失活,因此腹水收集后应尽快纯化,以防止降解。

大瓶培养:采用1000mL或更大的摇瓶培养。大瓶培养上清体积大,但抗体浓度低,给抗体纯化带来很大困难,消耗人力和培养液,增加生产成本。

中空纤维反应器:是比较经济的单克隆抗体生产方法。该装置由具有半透膜性质的成束的微孔纤维组成,杂交瘤细胞位于纤维外部的小量培养液中,培养液在纤维的微孔中循环,供给营养和带走废物,抗体大分子和小分子化合物被隔开。高密度的杂交瘤细胞能在此系统中维持数月,每天可产生数百毫克的抗体,抗体浓度高,体积小易于纯化。

胎(小)牛血清一直是细胞培养所必须的,在单克隆抗体生产过程中培养液中的血清蛋白使抗体的纯化增加了困难,近年开发的无血清培养技术已逐渐用于单克隆抗体的生产中。

人单克隆抗体的制备

小鼠的单克隆抗体蛋白应用于人体后,作为抗原能引起人的免疫应答,大大降低其生物活性,并可能导致变态反应。因此人源单克隆抗体在临床治疗上有广泛应用前景,引起人们的普遍兴趣。但是人单克隆抗体制备存在许多技术上和伦理上的障碍,如人杂交瘤细胞系不稳定,有些抗原不能对人进行人工免疫,人B细胞只能从外周血中分离而无法从脾脏取得等。尽管如此,一些人源单克隆抗体已经获得,技术上也在逐步完善起来。

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