血细胞常用的染色方法(2)

Wrfeht和Giemsa都于1902年报告了各自的新的血液学染色剂，其主要特点是在制备多色性亚甲蓝（主要指天青B）方面做了改进，使血细胞和疟原虫着色较好，操作简便。

上述染色法均是含伊红和亚甲基蓝衍生物的复合染料。在临床检验工作中，瑞氏染色法常用于血液、其他体液、分泌物和排泄物涂片中各种细胞的染色，有利于在显微镜下观察细胞形态及对细胞进行分类检查。

【染色原理】

瑞氏染色分两相进行，第一相是酸性染料伊红与细胞中的碱性物质如血红蛋白、嗜酸性颗粒等结合；碱性染料天青B与细胞中的酸性物质如核染色质（chro－matin）、特异中性颗粒、血小板及富含核蛋白的胞质结合。第二相是天青B和伊红在适宜条件下形成紫色的天青B一伊红复合物（azureB－eosincomplex），这种复合物是形成Romanowsky－Giemsa效应的基础。

Romanowsky－Giemsa效应包括：①白细胞核染色质染成紫色，疟原虫的染色质染成红色；②中性粒细胞的颗粒及血小板颗粒区染成紫色；③产生本效应必须有两种染料参与，一种是天青B，另一种是伊红。

Wittekind（1985）指出，天青B与DNA分子中的磷酸基结合，而伊红既与DNA分子中的阳离子部位结合，又与天青B结合，与天青B的结合力来源于电子供一受体的电子转移力，天青B的甲氨基（－NHCHs）与伊红分子中的叛基（－COOH）间形成氢键。因此，天青B是噻嗪类染料中能与伊红形成复合物的最佳选择，因为拥有四个甲基侧链的亚甲蓝不能以氢键与伊红结合。

甲醇除作为染料的溶剂，能将瑞氏染料解离成带正电荷的天青B和带负电荷伊红外，因其具有脱水力，还可将细胞固定为一定形态，并使蛋白沉淀为颗粒状、网状结构，增加细胞与染料的接触表面，增强染色效果。

细胞中的各种有机物质（特别是蛋白质）、染料等对环境的州值非常敏感。如环境偏酸，氢离子增多，降低对碱性染料的亲和力；增强伊红着色，出现异常红染；相反，则可出现异常蓝染。最佳环境应维持在PH值64～6、8.因此，必须使用缓冲溶液。

【试剂】

1、Wright染液 瑞氏染粉0.1g；甲醇60.0ml.

将瑞氏染料放入清洁干燥乳钵里，加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料溶完，甲醇全部用完为止。或将瑞氏染粉和甲醇直接置于棕色瓶中，加碎玻璃适量，立即用力振荡smin，置室温中，连续3天，每天振摇2～3次，促其溶解。配好后放室温，一周后即可使用。新配染液效果差，放置时间越长天青B越多，染色效果越好。久置应密封，以免甲醇挥发或氧化成甲酸，甲醇需用AR级。上述量染液中也可加中性甘油3ml，除可防止染色中甲醇过早挥发外，并可使细胞着色清晰。

1、磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.4～6.8）

磷酸二氢钾（无水）0.3g；

磷酸氢二钠（无水）0.2g；

蒸馏水加至1000ml.

配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。

【染色方法】

（1）用蜡笔在血膜两头划线，然后将血片平放在染色架上；

（2）加瑞氏染液数滴，覆盖整个血膜，固定细胞约lmin；

（3）滴加等量或稍多的缓冲液，与染液充分混匀，染色5～10min；

（4）用清水冲去染液，待干后镜检。

【染色结果】在正常情况下，血膜外观染成淡紫红色。显微镜下，红细胞呈粉红色，在厚薄均匀处，略有碟状感；白细胞浆中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩。细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。

染色偏酸，则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红，白细胞核呈淡蓝色或不着色。染色偏碱，则所有细胞呈灰蓝色，颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色，甚至紫黑或蓝色。中性颗粒偏粗、偏碱，染成紫黑色，血膜厚的部位呈绿色。

【注意事项】

1、未干透血膜的不能立即染色，否则染色时易脱落。

2、染色时间，与染液浓度、室温及细胞多少有关。梁液淡、室温低、细胞多，则染色时间长；反之则可减少染色时间。染液浓淡及染色时间长短要摸索，特别是更换染液时更应如此。

3、染液不能过少，以防蒸发沉淀，一旦染液沉淀在血膜上，则不易冲掉。

4、冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防染料沉着在血膜上。冲洗染料时间不能过长，以防脱色。冲洗完的血片应立放于架上，防止剩余水分浸泡脱色。

5、如血膜上有染料颗粒沉积，可用甲醇溶解，但需立即用水冲掉甲醇，以免脱色。

6、染色过谈，可以复染，复架时应先加缓冲液，创造良好染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。