川芎嗪对血管平滑肌细胞增殖及蛋白激酶C通路的影响

【摘要】目的观察川芎嗪对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖中蛋白激酶C（PKCζ）-细胞外信号调节激酶（ERK1/2）通路的影响。方法建立AngII诱导的VSMC增殖模型，测定细胞增殖活度，免疫细胞化学法检测PKCζ与ERK1/2表达。结果与对照组比较，AngⅡ组细胞增殖活度显著增高，PKCζ与ERK1/2表达显著高于对照组（均P<0.01）。中、高剂量川芎嗪组的细胞增殖活度明显降低（P<0.05或P<0.01），PKCζ与ERK1/2表达亦明显低于AngⅡ组（P<0.01），与低剂量川芎嗪组相比亦有显著差异，说明川芎嗪的抑制作用具有量-效关系。结论川芎嗪对AngⅡ诱导的VSMC增殖有显著抑制作用，其机制与抑制PKCζ-ERK1/2通路有关。

【关键词】川芎嗪；血管平滑肌细胞；蛋白激酶C；细胞外信号调节激酶

血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）增殖是血管再狭窄的一个重要发病机理特征［1］。蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKCζ）与下游的细胞外信号调节激酶（extracellularsignalregulatedkinase，ERK1/2）是多种信息分子胞内信号传递的共同通路［2］。研究显示［3］，PKCζ-ERK1/2通路参与血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）诱导的VSMC增殖。中药川芎的主要活性成分-川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）可以抑制VSMC增殖，但其作用机制目前尚不十分清楚。本实验应用AngⅡ建立VSMC增殖模型，观察PKCζ与ERK1/2表达的变化及川芎嗪对其的影响，探讨川芎嗪对VSMC增殖的抑制效应及作用机制。

1材料与方法

1.1动物及试剂

体重为120～150g的健康雄性SD大鼠（河南省实验动物中心）。细胞培养器材、胰蛋白酶（华美生物工程公司）；AngⅡ（Merck公司）；盐酸川芎嗪注射液（无锡市第七制药公司）；DMEM培养基（Sigma）；Sm-actin免疫试剂盒（SantaCruz）；PKCζ、ERK1/2抗体（武汉博士德）；其它试剂为分析纯产品。

1.2VSMC培养与鉴定

按组织贴块法以含20%胎牛血清的DMEM进行原代培养。光镜以及倒置相差显微镜下观察细胞呈梭形，生长至融合状态时呈现特有的峰与谷特点，同时经sm-actin免疫细胞化学染色进行VSMC鉴定，细胞阳性率在95%以上。

1.3分组

选择4～6代VSMC进行实验。分组①对照组（control）：不加特殊试剂，仅给予无血清DMEM培养；②AngⅡ组：AngⅡ10-7mol·L-1培养；③TMP低剂量组：20mg·L-1TMP孵育30min后再加AngⅡ培养；④TMP中剂量组：200mg·L-1TMP孵育30min后再加AngⅡ培养；⑤TMP高剂量组：2000mg·L-1TMP孵育30min后再加AngⅡ培养。

1.4MTT法检测细胞增殖活度

按上述方法接种于96孔培养板中培养24h后终止，换无血清DMEM培养24h，分组（同前）继续培养24h，每孔加入MTT溶液20μl，吸去培养上清液，加入二甲基亚砜振荡；选择490nm波长，在酶标仪上测定吸光度值（A值）。

1.5免疫细胞化学法检测

PKCζ与ERK1/2的表达0.25%胰蛋白酶消化制备细胞悬液，调整细胞密度为5×104·L-1，接种于6孔培养板中培养24h，无血清DMEM培养24h，分组（同前）继续培养24h.细胞爬片用PBS冲洗3次，冷丙酮固定后SABC法测定PKCζ与ERK1/2的表达。采用HPIAS-10009型发病机理图文分析系统进行图象分析，每张涂片400×显微镜下随机选择4个视野，计算其平均灰度值（医学网搜集整理）。

1.6统计学处理

数据用±s表示。计算机统计软件分析SPSS11.0，采用One-wayANOVA分析，两两比较LSD检验。

2结果

2.1TMP对培养的VSMC增殖活度的影响 AngⅡ组细胞增殖活度明显高于对照组（P<0.01）；与AngⅡ组比较，小剂量组增殖活度无显著差异，但有下降趋势，中、高剂量TMP组VSMC的细胞增殖活度显著降低（P<0.05），说明TMP能抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖效应。结果见表1.

2.2TMP对VSMCPKCζ表达的影响

以细胞浆或胞核出现棕黄色反应产物为阳性表达。计算机图象分析结果显示，AngⅡ组PKCζ表达显著高于对照组（P<0.01），与AngⅡ组比较，低剂量TMP处理后PKCζ表达呈下降趋势，中、高剂量TMP处理，PKCζ表达水平显著降低（P<0.01），并且随着TMP浓度增加，PKCζ表达显著降低。结果见表1.

2.3TMP对VSMCERK1/2表达的影响

以细胞浆或胞核出现棕黄色反应产物为阳性表达。经计算机图象分析，AngⅡ组ERK1/2表达显著高于对照组（P<0.01），与AngⅡ组比较，TMP低剂量组ERK1/2表达水平呈下降趋势，无明显差异；中、高剂量TMP处理，ERK1/2表达显著降低（P<0.01）；低剂量组相比亦有显著差异，说明其抑制作用具有浓度依赖性。结果见表1.表1TMP对VSMC增殖活度、PKCζ与ERK1/2表达的影响（略）

3讨论