延胡索中紫堇碱标准品的制备及含量测定

【摘要】 目的研究延胡索中紫堇碱标准品的制备及含量测定方法。方法运用半制备高效液相色谱法分离纯化紫堇碱，采用薄层色谱法和高效液相色谱面积归一化法检测纯度，波谱法鉴定其结构，反相高效液相色谱法测定延胡索药材中紫堇碱的含量。结果制备的化合物鉴定为紫堇碱，纯度为99.5%；含量测定在0.131 2 ～1.131 2 μg范围内呈良好线性关系，r = 0.999 997，平均回收率为97.19%，RSD为2.25%（n = 9）。结论该制备方法效率高，所得化合物纯度高，可用于大量制备；含量测定方法准确，简便，可靠，重复性好。

【关键词】 紫堇碱； 半制备高效液相色谱法； 反相高效液相色谱

延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang.为罂粟科植物延胡索的干燥块茎，具有活血化淤、理气止痛的功效，是我国传统常用中药。延胡索中主要含生物碱，其中延胡索乙素和丑素是延胡索镇痛的主要活性成分［1］，2005年版《中国药典》及成方制剂中均采用延胡索乙素为对照品进行评价［2～4］。本课题组研究发现，延胡索生物总碱具有较好的抑制乙酰胆碱酯酶的作用，其中紫堇碱是主要活性成分之一，因此，有必要对延胡索中紫堇碱进行定性鉴别和含量测定。但是，目前市场上还没有紫堇碱对照品的销售，并且也未见采用紫堇碱为对照品来评价延胡索质量的报道。本文报道延胡索中紫堇碱对照品的制备方法和含量测定方法。

1 仪器与材料

X-4型显微熔点仪（国产，温度计未校正）；INOVA-400型核磁共振仪 （TMS为内标）； KQ-250B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；高效薄层层析板（GF254，青岛海洋化工厂生产）；甲醇、乙睛为色谱醇，其他化学试剂均为分析醇，水为纯净水。

延胡索药材采自浙江省东阳市，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang.的干燥块茎。

2 方法与结果

2.1 紫堇碱粗提物的制备 延胡索块茎粗粉5 kg，用30倍量的70%乙醇40 ℃超声提取1 h，滤过，滤液减压回收溶剂，得乙醇提取浸膏。乙醇提取浸膏加入1%的盐酸溶液溶解，滤过。滤液用浓氨水调pH 9～10，用乙醚反复萃取，合并萃取液，减压低温回收溶剂，得紫堇碱粗提物。

2.2 色谱条件

2.2.1 制备的HPLC色谱条件 XTerra Prep RP-18柱（10 μm ，150 mm × 7.8 mm）；柱温为室温；检测波长280 nm；流动相为甲醇-0.03 mol/L的磷酸二氢钠（61∶39）；流速3.00 ml/min.

2.2.2 分析的HPLC色谱条件 DiamonsilTM C18柱 （5 μm， 250 mm× 4.6 mm），柱温30 ℃；检测波长280 nm，流动相为0.10 % 的磷酸（三乙胺调pH = 6.0） -乙睛（48∶52），流速1.00 ml/min.

2.2.3 紫堇碱对照品的制备纯化 取紫堇碱粗提物1.0 g，用10 ml甲醇超声溶解，过0.45 μm滤膜，备用。吸取1.0 ml样品进半制备型高效液相色谱仪，收集保留时间所在的组分，减压回收溶剂，得紫堇碱粉末。加乙醇适量溶解，重结晶，即得。

2.3 纯度分析

2.3.1 薄层色谱分析 薄层板：高效薄层层析板（GF254）。3种展开剂系统：正丁醇-乙酸-水（10∶1∶0.5）；醋酸乙酯-氯仿-甲醇-二乙胺（8∶2∶2∶1）；乙醚-环己烷-甲醇（5∶3∶0.5）。点样：在同一板上，按20，40，60，80，100 μl不同的浓度点样。展距8 cm，定位后经紫外254 nm、碘蒸气及碘化铋钾溶液显色检视。结果在薄层色谱同一位置处，均为单一斑点，未见杂质斑点，符合化学品要求。

2.3.2 紫外检测 取紫堇碱对照品乙醇溶液经紫外光谱扫描，结果表明最大吸收波长为280 nm，因此，确定280 nm为测定波长。

2.3.3 面积归一化法 精密称取紫堇碱对照品，用流动相制成浓度为0.13 mg·ml-1的样品溶液，按照“分析HPLC色谱条件”，进样10 μl，样品显示为单峰，用面积归一化法计算含量为99.5%（保留时间为12.15 min），符合中药化学对照品含量测定用要求。结果见图1.

2.4 结构鉴定 紫堇碱为无色棱状柱晶（乙醇），熔点135℃。1H NMR （400MHz， CDCl3） δ： 0.95 （3H， d， J = 6.8 Hz， CH3）， 2.60 （2H， m， 5-H）， 3.10 （2H， m， 6-H）， 3.22 （1H， m， 13-H）， 3.50 （1H， d， J = 16.0 Hz， H-8α）， 3.69 （1H， s， 14-H）， 3.87 （12H， m， 4-OCH3）， 4.20 （1H， d， J = 16.0 Hz， 8-Hβ）， 6.61 （1H， s， 4-H）， 6.69 （1H， s， 1-H）， 6.82 （1H， d， J = 8.4 Hz， 11-H）， 6.91 （1H， d， J = 8.4 Hz， 12-H）。 13C NMR （100 MHz， CDCl3） δ： 18.3 （-CH3）， 29.2 （C-5）， 38.2 （C-13）， 51.3 （C-6）， 54.4 （C-8）， 55.7 （OCH3）， 55.8 （OCH3）， 56.0 （OCH3）， 60.0 （OCH3）， 62.9 （C-14）， 108.5 （C-1）， 110.8 （C-4）， 111.0 （C-4）， 124.0 （C-12）， 128.5， 128.4， 128.2 （C-4a， -14a， -8a）， 134.8 （C-12a）， 144.7 （C-10）， 147.0 （C-2）， 147.5 （C-3）， 150.0 （C-9）。以上波谱数据与文献报道［5］的一致，故鉴定为紫堇碱。

2.5 延胡索中紫堇碱的含量测定

2.5.1 色谱条件与系统适应性实验 照“分析HPLC色谱条件”，样品的理论塔板数均大于10 000，分离度均大于4.0.结果见图2.