痰结核菌检查应在生物安全工作台内或在装有过滤装置的向室外排风橱内进行。

B1涂片检查方法

B1.1直接涂片法

痰标本：留取深咳痰标本约3～5mL于广口容器中。用折断竹签等物挑取脓样痰液0.1mL.放入载玻片中央处，均匀涂抹成2cm×2.5cm的卵圆形痰膜，如图B1.

自然干燥后，染色镜检。

涂片必须使用清洁、无划痕的新载玻片，一张玻片涂一份标本，载玻片只使用一次。

B1.2集菌痰涂法

痰标本，留取深咳痰标本或12～24h痰标本5～10L，于消毒处理的玻璃容器（约120mL）中，如痰量少且粘稠时加适量蒸馏水（不超过10mL），经高压蒸气灭菌器0.105MPa20～25min，冷却后供集菌涂片用。

B1.2.1离心集菌涂片法：取上述处理后的痰液5～10mL（不超过10mL）入50mL离心管内，加蒸馏水至50mL，以3000r/min转速（1750g离心力），离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片，自然干燥后，染色镜检。

B1.2.2漂浮集菌涂片法：取上述处理的痰液5～10mL入120mL容积的玻璃瓶中，加蒸馏水20～30mL（总量不超过瓶容积的三分之一），加二甲苯0.3mL，放振荡机上振荡10min（振荡机速率240次/min），取出平放台上，加蒸馏水满瓶口，静置10～15min，把标号的载玻片盖于瓶口上。放置15～20min，取下玻片平放台上，自然干燥后，染色镜检。

B1.3染色方法

B1.3.1抗酸染色法（Ziehl－Neelsen法）

B1.3.1.1染色剂配制

B1.3.1.1.1染色剂：取碱性复红8g，溶解于95%酒精100mL内，加5%石炭酸900mL，放置24h后过滤备用。

B1.3.1.1.2脱色剂：5%盐酸酒精。

B1.3.1.1.3复染剂：取亚甲蓝0.15g溶入95%酒精50mL，加蒸馏水至1000mL.

B1.3.1.2染色步骤

B1.3.1.2.1痰涂片火焰固定，平放染色架上。

B1.3.1.2.2加染色剂盖满痰膜，微火加温至染液呈现蒸汽，去火焰，染色5～10min（勿使染液呈现干涸），水洗。

B1.3.1.2.3加脱色剂盖满痰膜，脱色3～5min，至无红色，水洗。

B1.3.1.2.4加复染剂盖满痰膜，直接涂片复染30s，集菌涂片复染1～3min，水洗，干后，镜检。

痰涂片染色质量要求，涂片染色后，肉眼观察痰膜呈淡蓝或蓝色，不得有红色斑块，痰膜脱落部分在10%以下。镜下所见，视野背景清晰。在100×物镜的视野内于淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色杆菌，其他细菌和细胞呈蓝色。

B1.3.1.3镜检与报告

显微镜下（目镜10×，油镜100×）所见结果报告标准如下：

B1.3.1.3.1镜下计数100个视野（观察时间不少于4min），未发现抗酸菌者继续观察至300个视野，仍未发现抗酸菌者报告抗酸菌阴性（一）。

B1.3.1.3.2镜检100～300个视野找到抗酸杆菌1～2条者，报告抗酸杆菌可疑（±），或重新涂片或另留痰标本复查。

B1.3.1.3.3镜检100个视野内找到抗酸杆菌3～9条者，报告抗酸杆菌阳性（1＋）。

B1.3.1.3.4镜检10个视野内找到抗酸杆菌1～9条者，报告抗酸杆菌阳性（2＋）。

B1.3.1.3.5镜检每个视野内找到抗酸杆菌1～9条者，报告抗酸杆菌阳性（3＋）。

B1.3.1.3.6镜检每个视野内找到抗酸杆菌多于9条以上者，报告抗酸杆菌阳性（4＋）。

在痰涂片检查报告中应包括痰标本的性状和质量。

B1.3.1.4质量控制要求

为保证痰涂片检查质量，应建立和健全室内、室间痰菌涂片检查质量控制制度。室内质控应包括痰标本收集、涂片、染色标准和镜检结果复核等，室内质控应每日进行，绘制质控图。痰涂片保存供上一级实验室质控检查。

室间质控由上一级实验室定期进行。

痰涂片镜检结果质量要求，痰涂片阴性符合率在95%以上，涂片阳性符合率在98%以上，总符合率在96.5%以上。“1＋”以上的阳性痰片不允许出现假阴性。

B1.3.2荧光素染色法（金胺O法）

B1.3.2.1染色剂配制

B1.3.2.1.1染色剂：取金胺0.01g溶于95%酒精10mL内。加5%石炭酸至100mL.

B1.3.2.1.2脱色剂：3%盐酸酒精。

B1.3.2.1.3复染剂：0.5%高锰酸钾水溶液。

B1.3.2.2染色步骤

B1.3.2.2.1痰涂片火焰固定，平放染色架上。

B1.3.2.2.2加染色剂盖满痰膜，染色10～15min，水洗。

B1.3.2.2.3加脱色剂盖满痰膜，脱色3～5min，至无黄色，水洗。

B1.3.2.2.4加复染剂盖满痰膜，染色2min，水洗。干后，镜检。

B1.3.2.3镜检与报告

在暗色背景下，抗酸杆菌呈黄绿色或银白色荧光。

荧光显微镜检查，20×物镜计数，40×物镜观察抗酸杆菌形态，也有用40×物镜计数，菌体形态清楚，判断准确。

荧光染色后应在24h内完成检查，需隔夜时，置痰涂片于暗处保存，次日完成检查。

荧光显微镜20×物镜镜检结果按下列标准报告：

B1.3.2.3.130视野内未发现抗酸杆菌，报告抗酸杆菌阴性（一）。

B1.3.2.3.230视野内发现抗酸杆菌1～9条，报告抗酸杆菌条数。应以抗酸染色法（见B1.3.1）复染或涂片复检结果报告之医|学教。

B1.3.2.3.330视野内发现抗酸杆菌10～100条，报告抗酸杆菌阳性（1＋）。

B1.3.2.3.4平均每一视野内发现抗酸杆菌1～10条，报告抗酸杆菌阳性（2＋）。

B1.3.2.3.5平均每一视野内发现抗酸杆菌11～200条，报告抗酸杆菌阳性（3＋）。

B1.3.2.3.6平均每一视野内发现抗酸杆菌多于200条，报告抗酸杆菌阳性（4＋）。

B2分枝杆菌培养方法

B2.1培养基

B2.1.1改良罗氏培养基

成分：

味精（谷氨酸钠95%以上）7.2g；磷酸二氢钾2.4g；硫酸镁0.24g；柠檬酸镁0.6g；甘油12mL；蒸馏水600Ml；马铃薯淀粉30g；全卵液1000mL；2%孔雀绿20mL。