登革热诊断标准及处理原则附录B(2)

每一检材接种一窝l～3日龄小白鼠，每只脑内接种全血或1：10血清或蚊悬液、组织悬液10～20μL，接种后48 h内死亡者作非特异性死亡，弃去。存活者观察至10 d左右仍未发病时，剖取其中2只， 取脑，用pH8.0肉汤制成10%悬液，盲传1～3口龄小白鼠一窝，其余的及盲传的均观察至第四周。未发病作阴性结果：在观察期内若发病（松毛、蜷缩、活动力降低、站立不稳、抽搐、离群、不进食、瘫痪等症状）则削取半边脑，按盲传法制成10%鼠脑悬液，转种1～3日龄小白鼠，并作无菌试验。另一半脑置5.43 mol/L（50%）甘油缓冲液中低温保存。无菌试验阴性而重复以上症状的乳鼠作为可疑毒株传代、保种，并进行鉴定。

B3.5病毒鉴定

B3.5.1 问接免疫荧光试验（FA/IFA）

B3.5.1.1 脑组织片的制备；取发病濒死的小鼠脑组织以冰冻切片制成10孔组织片，经吹干，冷丙酮固定10 min，冲洗、吹干后放-20℃保存。正常脑组织同法制作。

P.3.5.1.2试验方法、结果和意义，同B2.5.

B3.5.2血凝抑制试验

原理、材料与方法参考人2.

意义：鉴定病毒和病毒分型。

a3.5.3补体结合试验

原理、材料与方法、意义参考A3.

s3.5.4中和试验

原理、材料与方法、意义参考A6.

B4 RT-PCR技术检测DF病毒基因及基因分型

B4.1原理

PCR技术（聚合酶链反应）是利用双链脱氧核糖核酸（DNA）分子碱基配对原则，在一定条件下扩增DNA片段的体外扩增方法。它的特异性取决于两个人工合成的寡核苷酸引物的序列。引物与待扩增片段两条链两段DNA序列分别互补，待扩增DNA在变性温度下分解为二条单链模板。在复性温度引物与模板两端的DNA序列分别复性（杂交，碱基配对）。在延伸温度和单核背酸存在的条件下，由TaqDNA聚合酶催化，引导引物的5，向3，方向延伸合成新链，是一个重复进行的热变性复性延伸的温控循环过程，随着循环次数的增加，DNA产量呈指数上升，经过20个循环以后，从微量基因材料。特异性地扩增可达数百万倍。

登革病毒含核糖核酸（RNA）基因组，因此PCR前需经过逆转录酶作用。合成第一条cDNA链（RT），再进行扩增（PCR），即RT-PCR.设计一对通用引物可扩增登革病毒组基因。设计不同型登革病毒的引物对，可扩增出不同的基因型病毒的基因产物。

B4.2材料及方法

（略）。

B4.3 意义

此法可对早期病例DV的检测及分型鉴定。