登革热诊断标准及处理原则附录B：登革热病原学检测

B1应用单克隆抗体免疫荧光法（mbAb-IFA）检测DV抗原

B1.1原理

感染DV的蚊虫体内，携带有DV抗原，可用DV单克隆抗体免疫荧光法检出蚁体内的特异性抗原。

B1.2材料

多孔载玻片、10～l00 μL可调加样器、染色钵、试管、pH7.2PBS Dl～D4型单克隆抗体、羊抗鼠IgG、丙酮等。

B1.3检测步骤（问接法）

B1.3.1 蚊虫标本制备：待蚊虫胃内容物消化后，置-40℃冻死，用解剖刀去翅，肢，将头部和躯体分别放于载玻片圈内，盖上一块与之相对应的玻片，轻轻加压，使蚊组织最大限度地附在玻片上，小心分开两玻片，用镊子去除大片的骨骼，吹干，冷丙酮固定10 min.

B1.3.2用PBS轻轻洗一次，再用蒸馏水洗一次，吹干。

B1.3.3加DF单克隆抗体，覆盏蚊组织，置于湿盒中，37℃水浴30 min.

B1.3.4取出，用PBS洗2次，蒸馏水洗1次，吹干。

B1.3.5加羊抗鼠lgG，如B1.3.3、B1.3.4，孵育，洗涤。

B1.3.6封片胶封片，荧光镜检。如单抗已荧光标记则免去BI. 3.5，即为直接法。

B1.4结果判断

用荧光显微镜观察，检出组织细胞质内有特异性黄绿色荧光，判为阳性医|学教，阴性无荧光出现。

B1.5 意义

在蚊虫组织中，检出DV抗原。可确诊被检蚊虫携带有DV，可用于登革热流行病学调查。

B2 C6/36白纹伊蚊细胞分离DV

B2.1原理

DV是一种具有严格的细胞内存活的生物，必须生活在活的细胞组织内。C6/36白纹伊蚊细胞对DV十分敏感，藉观察病毒对其产生的变化（病变等现象）和应用特异、敏感的检测技术，检出病毒的存在和型别。

B2.2材料

C6/36白纹伊蚊细胞、新生小牛血清、日本Eagles、青霉索、链霉素、各型DV单克隆抗休、羊抗鼠荧光IgG及免疫荧光试验用品。

B2.3检材的采集及处理

B2.3.1病人：无菌采集发病后5d内静脉血3 mL.放冰壶送实验室分离血清接种组织培养，不能及时接种的可放-20℃保存。对污染的血渍要先加青霉索、链霉素（最终浓度各为500 kU/L）。4℃作用2h处理后按种。接种后余下的血消为早期血清，供血济学试验用。

B2. 3.2尸体检材：可取血，脑行液、脑组织、肝等。

B2.3.3蚊：采集吸过血的埃及伊蚊。白纹伊蚊或其他可疑蚊种，用0.50 mol/L（10%）葡萄搪液喂养，至胃血完全消化后置-20℃，待死后按蚊种及捕获地点分组，以5～10只一组为宜，经生理盐水冲洗数次后，用研磨器研碎，每组加0.5 mL Hank's液，2 000 r/min离心15 min，取上清液加青霉素、链霉素【最终浓度1 MU/L（1 000 U/mL）】4℃过夜，备用。

B2.4病毒分离

C6136（白纹伊蚊纯系细胞株）传代细胞。待细胞长成单层后，倒去培养液，每管接种月Hank's液稀释成10-1的患者血清0.1mL或蚊悬液或组织悬液0.2 mL，37℃吸附l h后加维持液0.9 mL及0.8mL，置35 ℃静止培养，观察7天，若细胞出现膨大至融合，折光度增强、颗粒增多等现象，取细胞悬液0.1 mL，进行传代，仍出现同样病变者应保种并进行鉴定，若7天后细胞不出现病变，需盲传l～2代，仍不出现病变者用问接免疫荧光试验作进一步检查，阴性者作阴性报告。

B2.5间接免疫荧光试验（FA/IFA）鉴定DV

B2.5.1 试验方法

B2.5.1.1 细胞片的制备：把出现“++”病变的C6/36细胞管倒去维持液，（若不出现病变医|学教，则需培养7天再制片）用pH7. 2PBS洗2次后加PBS 3 mL，用滴管把细胞从管壁上吹下，吹散，2 000 r/min离心5 min，弃去PBS.加O～2 mLPBS把沉淤吹散，滴加在10孔的载玻片符孔中，电风扇吹干，加冷丙酮固定10 min，用PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次，吹干，-20℃保存。正常C6/36细胞对照按同法制片。

B2.5. 1.2试验方法：取出保存的待鉴定细胞片或腑组织片，吹干，于各孔中按顺序滴加4个型DV使用单位的单克隆抗体，备型2孔，对照2孔滴加PBS，置湿盒内37℃水浴30 min.取出用PBS冲洗3次，蒸馏水深洗1次，吹干，滴加含130 μmol/L（1 ：8 000）伊文思兰的2单位抗鼠IgG荧光抗体，置湿众内37℃水浴30 min，用PBS冲洗3次，蒸馏水漂洗1次，吹干，用甘油缓冲液封片，镜检，记录结果。

B2.5.2结果判断

特异性免疫荧光呈黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内，正常组织细胞被染成橙红色或暗红。

B2.5.3意义

从病人血液、组织或蚊媒中分离出DV，经鉴定，可确诊DV感染和病毒型别。

B3应用乳小白鼠分离DV

B3.1原理

新生小白鼠对DV十分敏感，藉观察病毒对其产生的致病等现象和应用特异、敏感的检测技术，检出病毒的存在和型别。

B3.2材料

同B2.2.C6/36白纹伊蚊细胞改用1～3日龄乳小白鼠。

B3.3检材采集及处理

参考B2.3.

B3.4病毒分离