梅毒辅助检查(2)

　　目前有四套扩增梅毒螺旋体DNA的系统：扩增47KDa膜抗原基因（tpp47基因），扩增39KDa碱性膜蛋白基因（bmp基因），扩增TpF1蛋白基因（tpf-1）或TyF1蛋白基因（tyf-1）和扩增tmpA基因。

　　三种扩增系统的引物序列：

　　47-1             CACAATGCTCACTGAGGATAGT    648-669

　　47-2             ACGCACAGAACCGAATTCCTTG    1284-1035

　　Tpp47-3  TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC     713-734

　　47-4     TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT    1187-1208

　　TP3      CAGGTAACGGATGCTGAGT       256-275

　　TP4      CGTGGCAGTAACCGCAGTCT      762-741

　　bmpTP5（探针） GACCTGAGGACTCTCAAATC 500-519

　　TP7      CTCAGCACTGCTGAGCGTAG      172-191

　　TP8      AACGCCTCCATCGTCACACC       788-769

　　F1       CTCTTCAAGGAGCTCAT         222-206

　　Tpf-1F2   AGACAGTGGTTATGCTC        77-61

　　或tyf-1F3（探针）ATTGCGCCAGCATGTAG   114-130

　　F4（探针）ATTGCGCCGGCATGTAG        114-130

　　（二）操作方法

　　1．采集标本，根据病人的情况可采取局部分泌物，抽取淋巴结液，羊水，血清，脑脊液。用适量的蒸馏水稀释，保存于4℃冰箱。

　　2．标本处理：目的是为了暴露梅毒螺旋体的DNA，消除标本对PCR的抑制物。采用下列处理方法。

　　①煮沸法：取10或20μl血清或CSF放入0.5ml微量离心管中，水浴煮10min后在冰浴中冷却，13000g离心10s，上清用作PCR分析。

　　②低速离心法：将100μl羊水，血清或脑脊液加入到900μl无菌磷酸缓冲液中，10000g室温离心10min，上清转入另外的微量离心管中，20000g4℃离心1h，弃上清，沉淀悬浮于50μl 无菌水中，直接煮沸10min，冰浴冷却，取40μl上清作PCR.

　　③碱裂解法：取收集标本100μl加于含1mol/L NaCl，1mol/L NaOH和0.1%SDS的溶液中煮沸1.5min，用400μl（0.5mol/L）Tris-HCl（pH8.0）中和。用相同体积的苯酚抽提，再以100μl 0.15mol/L NaCl抽提苯酚。整个600μl的溶液用相同体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提，然后用相同体积的异丙醇沉淀（-20℃过液）。13000g4℃离心15min，轻轻倒出上清，凉干。沿淀悬浮于51μl无菌水中，取20μl作PCR模板。

　　（三）PCR扩增

　　1．扩增47KDa膜抗原基因：100ml反应物含：10mmol/L TrisHCl（pH8.3），50mmol/L KCl，3mmol/L MgCl2，100μg/ml明胶，0.5μg引物（47-1和47-2），75mmol/LdNTPs，2.5U TaqDNA聚合酶。取不同量各种制备的DNA作模板，反应过程：94℃15s， 60℃1min， 72℃1min，循环40次，末次循环增加72℃10min延伸时间，取10ml反应物用1% 琼脂糖凝胶电泳分析。点杂交分析产物：取10mlPCR扩增产物加入10ml0.5mol/LNaOH-1.5mol/NaCl溶液中变性10min，用380μ11.5mol/L NaCl-1mmol/L Tris（pH7.2）中和，然后用Minifold I点膜，80℃真空处理膜2h，用496bp探针65℃杂交过夜。探针为引物47-3和47-4的PCR产物，用随机引物法标记.

　　2．扩增39KDa碱性膜蛋白基因：25μ1反应体系含：1×RT缓冲液，50mmol/L Tris-HCl（pH8.5），50mmol/LNaCl，4mmol/LMgCl2，2mmol/L DTT（二硫基苏糖醇），200μmol/L dNTP，100μmol/L引物（TP7和TP8），0.01%牛血清白蛋白（无DNase和RNase），1UTaqDNA聚合酶，5μ1样品，可加入0.05mmol/L四甲胺化氯增强PCR.

　　PCR1：先用引物TP7和TP8扩增出617bp片段，反应过程：94℃3min后进入循环过程：94℃1min，65℃1min，72℃1min，循环数为30或35，每一循环中72℃延伸递增5s，最后一次延伸时间延长到6min.

　　PCR2：再用巢居引物TP3和TP4扩增出500bp片段，PCR1产物用蒸馏水稀释10倍，取5μ1用作第二次扩增.PCR2中MgCl2和引物浓度分别为5mmol/L和20μmol/L引物（TP3和TP4），其它条件与PCR1相同。

　　PCR产物分析。①取10μ1反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳；②Southern印迹后，用寡核苷酸探针TP5（以32P作末端标记）杂交。

　　3．扩增TpF1蛋白基因TyF1蛋白基因：100μ1反应物含：50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl（pH8.4），2.5mmol/L MgCl2，0.2mg/ml明胶，1μmol/L dNTP，2mmol/L引物（F1和F2），2.5UTaqDNA聚合酶，10μ1经处理的兔睾丸梅毒螺旋体悬液，反应过程：94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 2.5min，循环40次，取10μ1PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，Southern印迹后，用tpf-1特异的探针F3和tyf-1特异物的探针F4分别杂交。