天然植物药蒽醌类化合物含量测定

滕义生 温增珍 刘伟红 许连环

蒽醌类化合物在天然植物药中较为常见，如百合科的芦荟，豆科的决明子、番泻叶，茜草科的茜草，鼠李科的鼠李，特别是蓼科蓼亚科植物中广泛存在，如大黄属、酸模属、蓼属等，重要的植物药如大黄、虎杖、何首乌、拳参等。除高等植物外，它们还存在于低等植物地衣类和菌类的代谢产物中。蒽醌类化合物在天然药物中以游离状态与苷的形式混合存在，游离态的约占总蒽醌的1/10-1/3，结合态常见的是葡萄糖苷。各种蒽醌及其苷都具有多方面的生物活性，重要的是致泻和抗菌作用。

蒽醌类化合物按结构的不同可分成羟基蒽醌类、氧化蒽酚及蒽酚类、二蒽酮类。目前其提取方法主要采用溶剂提取法，如浸渍、渗漉、连续回流提取等方式，所用的溶剂主要有乙醇、甲醇、氯仿、乙醚、苯、石油醚、吡啶、丙酮、硫酸溶液、盐酸溶液及氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化铵等溶液。其含量测定方法有重量法、荧光法、比色法、极谱法、薄层扫描法、高效液相色谱法等，而单味植物药或其复方制剂中的蒽醌化合物含量，一般以大黄素或大黄酸、1，8-二羟基蒽醌为标准测定游离蒽醌或总蒽醌，结合蒽醌的量等于总蒽醌减去游离蒽醌。

1 比色法

根据蒽醌类及其苷大多数是黄色或橙红色的，羟基蒽醌能溶于碱溶液中而显红或紫红色；蒽酚和二蒽醌与碱液不显红色，只能呈黄色，需经氧化成羟基蒽醌后才与碱作用显红色；羟基蒽醌类因结构不同与醋酸镁的甲醇溶液反应可显橙、红、蓝、紫等色的性质而比色测定（医学网搜集整理）。

1.1 标准曲线的绘制：取经五氧化二磷干燥24 h的大黄素（或大黄酸、1，8-二羟基蒽醌）对照品适量用碱液（1 mol/L 氢氧化钠溶液或其与2%氢氧化铵溶液的混合溶液）或0.5%-1%醋酸镁甲醇溶液定溶，在500-550 nm波长处扫描，在最大吸收波长处测定吸收度，以吸收度对浓度绘制标准曲线，线性范围4-24 μg/ml. 1.2 游离蒽醌的测定：取药物细粉或其制剂粉末适量（约相当于游离蒽醌1.5 mg）加乙醚（或氯仿）溶解或用索氏提取器回流提取至提取液无色。将乙醚挥干，残渣用甲醇溶解，加醋酸镁甲醇溶液至定容；或将乙醚提取液移入分液漏斗中，用碱液提取并定容【1】，比色测定，依标准曲线计算含量。

1.3 总蒽醌的测定1.3.1 先水解后提取：取供试品适量（约相当于总蒽醌1.5 mg），用酸液（1-7.5 mol/L硫酸溶液或1.5-6 mol/L盐酸溶液）20-30 ml【2，3，4】，水浴回流1-2 h，以使结合态的蒽醌苷水解，使蒽醌游离，再用乙醚（或氯仿）萃取，并将过滤的药物残渣及滤纸经50℃干燥后用乙醚回流提取，待索氏提取器内提取液无色，合并乙醚液，照游离蒽醌测定法测定。

对含还原型蒽酮苷（如番泻苷）的样品，根据其可被三氯化铁氧化，酸水解成氧化型蒽醌苷元这一原理，称取供试品适量，加水30 ml超声处理15-30 min（提高溶解、提取效率，大大缩短溶解、提取时间），加10.5%三氯化铁溶液20 ml，回流20-60 min【3】，再加盐酸1-3 ml继续回流30 min，放冷，再进行萃取与测定。

因蒽醌类与碱液显色后，过氧化氢不能使其褪色，而其它有色物质可被其氧化褪色的原理，对含有干扰测定成分的碱萃取液【2】，加1%过氧化氢溶液少量，在沸水浴中加热4 min氧化，冷却，定容，比色测定。

1.3.2 先提取后水解：取供试品适量，加甲醇（或乙醇、氯仿等），对含蒽醌的浸膏制剂，超声处理30 min【5】，使溶解，对含蒽醌的原植物药粉末制剂，应置索氏提取器中回流提取，至提取液无色，将甲醇回收至干，残渣用酸液水解，乙醚（或氯仿）萃取，依法测定。

2 差示分光光度法

羟基蒽醌与碱液或醋酸镁甲醇液能产生颜色变化，使吸收峰由450 nm左右移至520 nm左右，而其它蒽醌及蒽类与之没有颜色变化，与其它有色物质均可干扰羟基蒽醌的含量测定，可用分光光度法。如为防止处方中的其它化合物对测定的干扰，取供试品提取液两份【6】，一份用0.5%的醋酸镁甲醇液至定容，为测定液；另一份用甲醇至定容，作为空白，于520 nm处测定△A值，依标准曲线计算含量。线性范围为4-12 μg/ml.

3 薄层扫描法

采用双波长薄层扫描法测定蒽醌类含量，其层析扫描条件为：硅胶H-CMC薄层板，石油醚（30-60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15：5：1）上层溶液展开剂【7】；或硅胶G-CMC薄层板，展开剂：正己烷-醋酸乙酯-甲酸（30：10：0.5），展距12 cm【8】；或甲苯-醋酸乙酯-甲酸（15：2：1）上层溶液为展开剂【9】。双波长反射法锯齿扫描，λS：430-445 nm，λR：630-650 nm；SX=3，狭缝1.2×1.2 mm，灵敏度中，线性范围：0.1-1.3 μg，用外标两点法定量，3 h的扫描数据稳定。

4 高效液相色谱法（HPLC）