包虫病诊断标准附录C(2)

C.4.2.2 加待检血清及参考血清（每板作阴性对照一孔、阳性对照一孔）每孔10 μl，混匀，置湿盒37℃ 5 min（或25℃室温10 min）。倾去血清，用PBST连续洗8次，甩干；

C.4.2.3加酶标抗体：每孔加工作浓度酶标抗体 200 μl，37℃ 5 min，同上洗涤8次，再加蒸馏水洗一次，甩干；

C.4.2.4 加底物显色：每孔加TMB底物200 μl，反应5 min～10 min（TMB底物溶液的制备：TMB 50 mg溶于10ml二甲基亚砜中作为母液，4℃保存。用前取母液1ml＋pH 5.0柠檬酸缓冲液50ml＋30% H2O2 8 μl）。

C.4.3 结果判断

参照阴性及阳性对照，用目视法判断结果。阴性基本无色，阳性为鲜蓝色。

C.5 免疫印迹技术（Western blot，WB）

C.5.1 抗原膜制备

囊液粗抗原、原头节粗抗原或特异性纯化抗原进行常规SDS-PAGE凝胶电泳，分离胶浓度为15%，抗原蛋白经SDS～PAGE电泳分离后，再转移到硝酸纤维膜上。经Ponceau S染色，标记标准分子量位置。将抗原膜用封闭液（3%脱脂奶粉，0.15 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.02%吐温～20）封闭1 h后将膜裁成宽2-3 mm的膜条备用。此抗原膜条，可夹在PBS湿滤纸中封于塑料袋内，4℃保存备用医学|教。若置低温冰箱中，可长期保存。

C.5. 2 操作方法

C.5.2.1 将抗原膜置于反应槽中，加入用封闭液（3 %脱脂奶粉，0.15 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.02%吐温～20）1：100稀释的待检血清，每批试验应设参考阳性、阴性和PBS对照。室温振摇2 h（4℃可过夜）。次日，用上述封闭液洗4次，每次5 min；

C.5.2.2加入工作浓度的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IgG，室温2 h，同前洗涤；

C.5.2.3加入二氨基联苯胺（DAB，棕色）显色至清晰后，蒸馏水终止反应，将反应膜干燥保存。

C.5.3 判读结果

细粒棘球蚴特异性反应条带：8 kDa、16 kDa、20-24 kDa（AgB）和38 kDa（Ag5）

多房棘球蚴特异性反应条带：18 kDa（Em18）、54 kDa（Em2）和220 kDa（EmAP）

C.6 循环抗原检测（circulating antigen，cAg）

C.6.1 特异性单克隆或多克隆抗体的制备

C.6.1.1用粗抗原或特异性抗原免疫Balb/c小鼠，按常规方法进行细胞融合、阳性细胞克隆筛选和鉴定，将分泌特异性单克隆抗体的细胞株腹腔注射小鼠，获得单克隆抗体腹水；

C.6.1.2 用粗抗原或特异性抗原免疫兔，获得高效价的多克隆抗体；

C.6.1.3建立可检测粗抗原或特异性抗原的敏感的双抗体夹心ELISA方法；

C.6.1.4用建立的双抗体夹心ELISA反应系统检测病人血清中的cAg.

C.6.2 循环抗原检测

C.6.2.1 将特异性单克隆抗体或多克隆抗体用0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度包被酶标板，每孔100 μl，4℃过夜后用PBST洗板3次；

C.6.2.2每孔加入含3%BSA的PBST 100 μl，于37℃封闭1 h，洗板3次；

C.6.2.3 待检血清用上液1∶2稀释，每孔加100 μl，37℃温育1h，洗板3次；

C.6.2.4 加工作浓度的酶标记第二抗体（特异性单抗或多抗）100 μl 37℃ 1h后，洗板3次；

C.6.2.5 加邻苯二胺（OPD，橙红色）或四甲基胺/四甲基联苯胺硫酸盐（TMB/TMBS，蓝色）底物溶液100 μl，37℃，30 min；

C.6.2.6 加入50 μl 2 mol/L H2SO4，终止反应；

C.6.2.7 酶标仪测各孔吸光值；

C.6.2.8 对照设置和结果判定：每板设阳性对照一孔（1 μg/ml抗原100 μl），阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值＋3SD或S/N≥2.0为阳性临界值。

C.7 循环免疫复合物检测（circulating immune complex，CIC）

C.7.1 检测CIC中的循环抗原

C.7.1.1. 用0.01 mol/L pH8.4硼酸盐缓冲液将PEG6000配成7%溶液，取此液100 μl加等量1∶2待检血清混合置室温下1h后，5000 r/min离心1 h；

C.7.1.2 吸去上清液，在沉淀中加含有8 mol/L 尿素的0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液0.5ml，溶解沉淀物；

C.7.1.3. 用此液包被酶标板每孔100 μl，每份标本包被两孔，4℃过夜后，洗板3次（阳性及阴性对照同样处理）；

C.7.1.4. 每孔加含有2%BSA的PBST 100 μl，37℃封闭1 h，洗板3次；

C.7.1.5. 加入HRP标记的工作浓度特异性单抗或多抗100 μl，37℃下1h后洗板3次；

C.7.1.6 加邻苯二胺（OPD，橙红色）或四甲基胺/四甲基联苯胺硫酸盐（TMB/TMBS，蓝色）底物溶液100 μl，37℃，30 min.

C.7.1.7. 加入2 mol/L H2SO4 50 μl终止反应；

C.7.1.8 酶标仪测各孔吸光值；

C.7.1.9 对照设置和结果判定：每板设阳性对照一孔（1 μg/ml抗原100 μl），阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值十3 SD为阳性临界值。

C.7.2 检测CIC

C.7.2. 1 特异性抗体的制备同C.6.1；

C.7.2.2 将特异性单克隆抗体或多克隆抗体用0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度包被酶标板，每孔100 μl，4℃过夜后用PBST洗板3次；

C.7.2.3 每孔加入含3%BSA的PBST 100 μl，于37℃封闭1 h，洗板3次；

C.7.2.4 待检血清用上液1∶20稀释，每孔加100 μl，37℃温育1h，洗板3次；

C.7.2.5 加工作浓度的酶标记抗人IgG或IgM 100 μl 37℃ 1h后，洗板3次；

C.7.2.6加邻苯二胺（OPD，橙红色）或四甲基胺/四甲基联苯胺硫酸盐（TMB/TMBS，蓝色）底物溶液100 μl，37℃，30 min.

C.7.2.7加入2mol/L H2SO4 50 μl终止反应；

C.7.2.8酶标仪测各孔吸光值；

C.7.2.9对照设置和结果判定：每板设阳性对照一孔（人工复合物），阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值＋3SD或S/N ≥2.0为阳性临界值。