蛋白质一级结构的测定方法-主管药师考试
小编搜集了有关主管药师考试的复习知识点,供广大考生参考;如下
1.多肽链的分离
在测定一个蛋白质的结构以前,首先必须保证被测蛋白质的纯度,使结果准确可靠。其次要了解它的分子量和亚基数,按照其亚基数将蛋白质分成几个多肽链。
1)肽链的拆开
蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多肽链,必须采用的化学处理方法常有:
①过甲酸氧化
用氧化剂过甲酸断裂-S-S-.这个反应一般在0℃下进行2小时左右,两个S就全部能转变成磺酸基,这样被氧化的半胱氨酸称为磺基丙氨酸。
②巯基乙醇还原
利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S-断裂。当高浓度的巯基乙醇在pH8?条件下室温保温几小时后,可以使-S-S-定量还原为桽H.与此同时反应系统中还需要有8摩尔脲或6摩尔盐酸胍使蛋白质变性,多肽链松散成为无规则的构型,此时还原剂就可作用于-S-S-.此反应是可逆的,因此要使反应完全,疏基乙醇的浓度必需在0.1-0.5摩尔。
③Cleland试剂的还原作用
Cleland′s指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二硫苏糖醇(dithiothriotol)在氧化还原能力上是比较强的试剂,只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原,反应基本与疏基乙醇相似,且在许多球蛋白反应中,可以不用变性剂。
2)末端分析
(1)N-末端测定
A.二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年Sanger提出此方法,是他的重要贡献之一。
(2)C-末端分析
A.肼解法:这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中,100℃下进行反应,结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放,而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。
3)氨基酸组成分析
在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前,首先应了解它是由那几种氨基酸组成的,每种氨基酸有多少?分析组成的方法有:
①层析法
将多肽链完全酸水解成游离氨基酸,然后进行Dansyl标记,聚酰胺薄膜层析,此方法在蛋白质结构分析中是一种超微量的分析术,但此方法用于定量分析尚不够准确。
②离子交换层析法
Spaekman等发展了一种精确的氨基酸组分的定量方法。他们采用磺酸型的离子交换树脂,这是一种高分子量的固体聚苯乙烯,带有大量的功能基团,磺酸基在低pH和低离子强度条件下,根据氨基酸的酸碱性,氨基酸带正电,于是替换下树脂上的Na+,借助静电作用而结合到磺酸基上。
2.多肽链的降解
多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂,因此直接分析多肽的氨基酸顺序还是很困难的,多采用将多肽链进一步降解成为更小的片段,然后再行分析。肽键的裂解是一级结构研究工作中的重要问题,它要求裂解点少,选择性强,而且反应产率高,目前主要有化学法和酶解法两类。
1)化学法
(1)溴化氰法 是最理想的化学方法,能选择性断裂甲硫氨酸所在的肽键
(2)部分酸水解法
Sanger在分析胰岛素的一级结构中采用了此法,即用0.1N盐酸在110℃或用6N盐酸在37℃水解。这种部分酸水解的方法特异性不强,因此对大片段的蛋白质和肽均不合适。
(3)羟胺法
这种方法近十年来开始受人注意,羟胺能专一性地裂解Asn睪ly的肽键,酸性条件下裂解Asn-Pro肽键。已用于某些蛋白质的分析。
(4)N-溴代琥珀酰亚胺法
主要裂解Try处的肽键,五十年代研究较多。但由于它也能断裂Tyr睭is肽键,因此应用不广。
2)酶解法
酶水解法较化学法具有更多的优越性,使用也更广泛。因其具有较高专一性,而且水解产率较高,所以可以选择各种不同专一性的酶进行专一性的断裂。
常用的酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。
胰蛋白酶专一断裂Lys,Arg的羧基侧肽键,如果对Lys,Arg,CysH进行化学修饰可改变胰蛋白酶的断裂性质。
(1)赖氨酸的修饰。将Lys用顺丁烯二酸酐或甲基顺丁烯二酸杆修饰,则胰蛋白酶仅使Arg肽键断裂。
3.肽段的分离
大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法,由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。单用凝胶过滤法分离之肽一般纯度不高,常需辅以离子交换层析法,大片段肽可用离子交换葡聚糖作载体,小肽则多用Dowex-50等树脂。
小肽分离还常采用高压电泳与层析相结合的指纹图谱法,得到纯净肽。
4.肽的顺序分析
在蛋白质一级结构的测定中,肽的顺序分析是比较重要的一步。肽的顺序分析也有化学法和酶解法两种。
5.二硫键定位
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