复发性口腔溃疡和消化性溃疡患者口腔及胃粘膜中的幽门螺杆菌

　　条件控制：

　　①所有受检者取样前1周内未服用任何抗生素、铋剂、抗酸剂及H2受体拮抗剂，1个月内未服用类固醇类药物或非类固醇类抗炎药如阿司匹林等；②所有受检者均无严重全身性系统疾病，非Ⅱ度或Ⅱ度以上牙周炎患者、非口腔粘膜扁平苔藓患者；③各组间年龄、性别、取样位置和方法、患者牙周条件等可控制因素通过均衡检验，证实无差异，具有可比性。

　　Hp-PCR检测方法：

　　所有受检者检测晨均按指导刷牙，取样前用无菌生理盐水轻轻将口腔漱干净，然后刮取每位受检者颊、舌、口底、软腭粘膜少许（ROU患者以溃疡假膜代替相应部位的口腔粘膜），同时通过胃镜取胃体部粘膜（PU患者取溃疡部位）作为标本，置于无菌生理盐水的尖嘴离心管，-40℃保存备检。将备检标本放入400μl无菌生理盐水溶液中离心12000r/min×5min，弃上清，加DNA裂解液50μl，蛋白酶K2μl，55℃孵育1h，100℃水浴10min，同时设置阳性模板和阴性对照（PacificEcon-TechCo.USAPCR试剂盒）；15000r/min×5min离心后，取5μl进行PCR检测。PCR扩增产物取15μl，用15g/L琼脂糖凝胶（含0.5g/L溴化乙锭）经TAE电泳缓冲液，电泳30min（电压5v/cm）后在紫外透射反射仪300nm下观察结果，如果在200bp处出现橙黄色条带，则诊断为Hp阳性（+）。

　　胃粘膜Hp培养：

　　C组口腔Hp阳性患者的胃粘膜做Hp培养，以使与口腔Hp比较。在幽门前5cm范围内用灭活活检钳钳取组织2块，置于装有30%甘油/布氏肉汤转送液0.5ml无菌离心管中-20℃保存。用改良Skirrow培养基，在含6%微氧条件下37℃培养2～4天后观察医学教育 网搜集整理。

　　口腔Hp抗Hp免疫荧光抗体染色：

　　①荧光抗体的制备：胃粘膜培养出来的Hp4株混合配制成每毫升10亿个细菌的悬浮液，耳缘静脉注射免疫家兔，8次后查血，凝集效价为1：2560，特异性实验与大肠杆菌、空肠弯曲菌凝集效价均不超过1：80.抗体血清用不饱和硫酸铵提成粗球。再用0.25mol/L硫酸盐缓冲液将粗球抗体稀释成1%浓度后装入透析液中，用同一缓冲液将异硫氰酸荧光素配成0.1g/L，10倍于1%抗体体积，放入烧杯中，用电磁搅拌器在4℃冰箱内透析24小时，经sephadex-G50层析，去除游离荧光素。②染色方法：将口腔溃疡假膜稀释于0.1ml的生理盐水中，搅匀后涂于盖玻片上，经固定后滴上荧光抗体，置于37℃暗室冰箱中30分钟，再经pH值7.2的硫酸盐缓冲液冲洗3次，封片。荧光显微镜观察，以胃粘膜培养出的Hp作阳性对照。